均孔 β-磷酸三钙骨支架的制备与表征
雷 力1, 万荣欣1, 胡帼颖1, 刘欣1, 顾汉卿1,2
【摘要】 挤出沉积快速成型技术具有极高的材料适用性和柔性，因此其在成形方面显示出优势。为了研究骨组织工程支架的孔结构，研究制备了符合浆料要求的微纳米 β- 磷酸三钙(β-TCP)粉体和具有不同孔径的均孔支架。根据该技术对浆料的要求，研究制备了具有良好分散性、稳定性的 β-TCP 粉体和浆料。随着聚乙二醇（PEG20000）量的增加，所得粉体纯度更高、结晶更完整、分散性更优;当 pH=9.5，分散剂聚丙烯酸铵（PAA-NH4）含量为 1%(与粉体质量相比)时，粉体在浆料中能够获得良好的分散稳定性。结合烧结工艺，通过挤出沉积成形技术制备了 β-TCP 支架。调整工艺参数，制备出具有均匀可控结构、良好联通性的支架，孔径范围在 200~800 μm 之间。
【关键词】 生物医用材料；均孔；快速成型；支架材料；聚乙二醇
中图分类号：R 318.08 文献标志码：A 文章编号：1005-0809（2019）02-0001-06
Preparation and Characterization of Bone Scaffold of β-Tricalcium Phosphate with Mean Pore
LEI Li 1，WAN Rong-xin1，HU Guo-ying1，LIU Xin1，GU Han-qing1,2
(1. Tianjin Institute of Urological Surgery, Tianjin Medical University, Tianjin 300211, China;
2. Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine, Shanghai 200011, China)
【Abstract】 The technology based extrusion and deposition of the technology,because of its high adaptability and flexibility, shows the advantages on forming. In order to study the structure of the scaffold for bone tissue engineering, β -thricalcium phosphate （β-TCP）powder and scaffold with different sizes of pore are prepared. According to the requirements of slurry, β-TCP powder and slurry with high concentration, good dispersibility and stability were prepared. With the increase of PEG20000, β-TCP were prepared with higher purity, crystalline state, and better dispersion; and when pH=9.5, the dispersing agent PAA-NH4 is 1% (compared with the powder weight), there is good dispersion stability in slurry for β-TCP powder. Combining with sintering process, the scaffolds were formed by the technology. With the adjustment of the process parameters, prepare the uniform scaffolds with the controllable structure and good connectivity. The range of the pore size is 200-800 μm.
【 Key words 】 inorganic non-metallic materials; mean pore; rapid prototyping; scaffold; polyethylene glycol
作者单位：1. 300211 天津，天津医科大学天津市泌尿外科研究所；2. 200011 上海，上海交通大学医学院附属第九人民医院基金项目：国家重大科学研究计划（973-2012CB933600）
通讯作者：顾汉卿, E-mail:cjbmee@263.net
前言
人类骨组织由于肿瘤、炎症、外伤等可能会导致骨的缺损[1-2]。虽然骨组织工程改变了传统的骨缺损修复治疗模式，但是当前的支架还存在微细结构不可控的问题。主要是由于三维精细结构的成形严重依赖于制备技术[3]，挤出沉积成形技术是一种基于连续式流态直写技术的成形方法，其工作原理是釆用压缩空气或电机产生的压力来实现流态材料（墨水或浆料）从容料腔或注射器中挤出，并按照设定路径以连续丝的方式沉积在基材上[4-7]。
β-TCP 是一种理想的骨组织工程支架材料，因其与人体骨骼组织的无机成分相似、生物相容性好、易降解、无毒副作用等优良的生物性能，一直受到研究者的重视[1-2]。本文以均孔 β-TCP 为研究对象，制备符合挤出浆料要求的高浓度微纳米粉体，建立 β-TCP 支架可控制备工艺体系，制备不同孔径的支架。通过材料学测试与生物学评价，探讨支架微观结构、烧结工艺等与力学性能、降解性、生物学性能的关系，总结并提出材料微观结构可控制备及其性能优化的途径和方法[3]。
- 材料与方法
- β-磷酸三钙粉体的制备方法
按 Ca/P 比为 1.5 称取 Ca(NO3)2 和 (NH4)2HPO4，加入 PEG 分散剂，pH 值 10，反应温度为 6℃，反应过程中生成絮凝状沉淀物，洗涤、冷冻干燥、热处理得到磷酸 钙 粉 体 。 分 别 采 用 不 同 的 PEG（PEG=6000， PEG=20000），依次按照一定比例加入 PEG 和反应物，制备粉体。
- β-磷酸三钙支架的制备方法
设计CAD 模型：半径 5 mm，高为 10 mm 的圆柱体。利用挤出沉积成形系统，选择针头直径 0.21 mm，工作台移动速度 Vxy：20 mm/s）， 活塞挤压速度 Vp： 0.0006 mm/s，层高h：0.4 mm 制备出不同孔径的支架。待样品干燥后，按照以下烧结制度进行热处理，控制升温速度为 3～5℃/min。支架烧成制度为：室温→250℃
（恒温 1 h）→350℃（恒温 1 h）→500℃（恒温 1 h）→ 800℃（恒温 1 h）→1050℃（恒温 1 h）→随炉冷却。
- 材料检测与表征
釆用激光粒度分布仪测定 β-TCP 粉体的平均粒
径与粒度分布；采用 X 射线衍射仪测试粉体物相和支架组成成分；釆用 SEM 观察粉体和支架的微观形貌； 与老鼠成纤维细胞 L929 共混培养后，釆用 SEM 观察支架的微观形貌；采用万能力学测试机测试支架的抗压强度。
- 结果与讨论
- 粉体物相分析
由图 1 分析可得：分散剂的加入量对粉体的晶型有影响。刘斯倩，翁文剑等[8]通过实验也证明了 PEG6000 的量对 TCP 的晶型有重要的影响。添加量小于阈值， 随着添加量的增加，粉体的晶型由 α-TCP 向 β-TCP 转变；添加量大于阈值，随着添加量的增加，粉体的晶型由 β-TCP 向α-TCP 转变。晶型的不同主要是因为分散剂 PEG 对 ACP 的形成有影响。反应温度为 6℃ 时，在反应体加入了 PEG20000，从而获得了稳定的ACP。研究工作表明，在液相沉淀法制备 β-TCP 粉体的过程中，PEG 的加入量对 β-TCP 粉体的结晶状态有影响。聚乙二醇能稳定 ACP 就是因为 PEG 分子中的氧原子能和 Ca2+ 发生络合反应。一般认为，这些长链有机物因与 Ca2+ 作用而吸附于 ACP 颗粒的表面， 阻止了 ACP 颗粒的长大，从而减小了 ACP 的溶解度， 也阻止了 ACP 在溶液中结构的变化，使得其在溶液中能够稳定的存在。
图 1 PEG 在不同添加量下制备的β-TCP 粉体的XRD (a) PEG20000; (b)PEG6000
- 粉体微观形貌分析
如图 2 所示, 为采用不同分子量的 PEG 制备β-TCP 时，中间产物 ACP 的 SEM 形貌照片。图 2b～ d 为加入分散剂 PEG20000 制备粉体的 SEM 照片，粉体形貌呈不规则球状，样品团聚较严重。加入量为 1∶ 12 比 1∶20 能够改善团聚状况。图 2b 显示，当添加量为 1∶12 时样品，粒径主要有大粒径和小粒径两部分， 大粒径团聚较严重，小粒径的分散较好。随着 PEG 量的增加，大粒径颗粒的团聚得到了改善(见图 2c，2d)。图 2a,2f 为加分散剂 PEG6000 所得粉体的 SEM 照片， 粉体形貌呈不规则球状。与加入 PEG20000 的相比较，团聚得到了一定的改善，但是颗粒粒径较大。
图 2 β-TCP 粉体的SEM 照片
(a) PEG6000 1∶16; (b)添加PEG20000 1∶12;
(c)和(d)添加PEG20000 1∶16; (e)PEG20000 1∶20; (f) PEG6000 1∶16
- 粉体的粒径分析
图 3a 显示了将粉末在酒精中超声分散后动态光散射测试结果。由图可知，粒径分布在 500 nm 和6 μm 附近。图 3b，3c 显示了将粉末在纯水中超声分散后粒度分布测试结果。由图 3b 可知，中位粒径为 6 μm， 粒径分布在 1～10 μm 之间，分布较窄，较为均匀。与图 3a 显示结果一致。
图 4 不同孔径的支架材料的SEM 照片
（a）~（f）支架孔径分别为 300、400、500、600、700、900 μm
- 支架生物相容性分析
如图 5 所示， 细胞聚集再微孔集中的地方25~50 μm，图 5b，5c 反映出细胞的迁移途径，表明细胞富集在 500 μm以内的孔径内黏附、增殖。其余的细胞顺孔道下移到支架内侧的其它区域。宏观的大孔径目前比较公认的有利于骨组织长入的最佳孔径是在150~500 μm[10~11]；而允许可见的骨组织通过的连通通道至少为 40 μm。Lu 等[12]研究认为，材料的孔隙大小应当满足骨单位和骨细胞生长所需的空间，材料内部连通气孔的孔径为 5～40 μm时允许纤维组织长入，孔径为 40~100 μm时允许非矿化的骨样组织长入，孔径尺寸大于 150 μm时能为骨组织长入提供理想的场所， 孔径大于 200 μm是骨传导的基本要求，孔径在 200～ 400 μm 最有利于新骨生长。
图 5 细胞培养后支架SEM 图片
（a）孔径为 600 μm 的支架；（b）和（c）L929 细胞在支架上黏附；
（d）支架材料的组成颗粒